海洋发光细菌和淡水发光菌--吾爱海洋

发光细菌作为毒性检测的生物学方法，因其简便、快速、灵敏且成本较低而日益受到重视。本试验项目推荐两个方法。一为国家环境保护局于1995年发布的发光细菌法（GB/T15441-1995)，采用的是海洋发光细菌菌种；二为淡水发光菌法，采用的是淡水型发光菌种。
　　明亮发光杆菌T3法（A)
6 H: A( m5 m8 `- w# o9 s5 D　　本方法适用工业废水、纳污水体及实验室条件下，可溶性化学物质的水质急性毒性监测。
　　1．原理
　　基于发光细菌相对发光度与水样毒性组分总浓度呈显著负相关（P≤0.05)，因而可通过生物发光光度计测定水样的相对发光度，以此表示其急性水平。
1 p$ L# g1 R+ ?　　水质急性毒性水平可按选用相当的参比物 HgCl2浓度（以mg/L为单位）来表征，或选用EC50值（半数有效浓度，以样品液百分浓度为单位）来表征。
　　2．样品的采集与保存
　　①采样瓶使用聚四氟乙烯衬垫的玻璃瓶，务必清洁、干燥。采集水样时，瓶内应充满水样不留空气。采样后，用塑胶带将瓶口密封。
　　②毒性测定应在采样后6h内进行。否则应在生化培养箱2-5℃下保存样品，但不得超过24h。报告中应写明水样采集时间和测定时间。
2 x+ O3 u$ Q6 `) {( M　　③对于含固体悬浮物的样品须离心或过滤去除，以免干扰测定。
　　3．仪器设备
　　①生物发光光度计：配置2ml或5ml测试管。
/ Y3 r8 u& y& U　　当 HgCl2标准溶液浓度为0.10mg/L时，发光细菌的相对发光度为50%，其误差不超过±10%。
　　②2ml或5ml测试样品管（具标准磨口塞，为制造比色管的玻璃料制作，由专业玻璃仪器厂制造），分别适用于相应型号的生物发光光度计。
　　③微量注射器：10μl。
, o, T; l9 w& Z1 `　　④注射器：lml。
7 ~: B% n% D" O7 q$ h0 F　　⑤定量加液瓶：5ml。
　　⑥吸管：2ml、10m1、25ml。
　　⑦试剂瓶：l00ml。
　　⑧量筒：100ml,500ml。
( K1 X2 ~5 j5 D( [: \/ M6 U# X6 V　　⑨棕色容量瓶：50ml、250ml、1000ml。
　　⑩半微量滴定管（配磨口试液瓶，全套仪器均为棕色）：l0ml。
　　4．试剂和材料
5 T, A- J, b1 `' ~　　除另有说明外，本方法所用试剂均应为符合国家标准的分析纯试剂、蒸馏水或同等纯度的水。
9 b5 S$ x5 _6 `3 _  T　　① HgCl2。
　　②氯化钠NaCl，化学纯。
　　③明亮发光杆菌T3小种（PhotobacteriumphosphoreumT3spp.）冻干粉，安瓶瓶包装，每瓶0.5g，在2-5℃冰箱内有效保存期为6个月。新制备的发光细菌休眠细胞（冻干粉）密度不低于每克800万个细胞；当按5(3)④步骤将冻干粉复苏2min后即发光（可在暗室内检验，肉眼应见微光），稀释成工作液后每毫升菌液不低于1.6万个细胞（(5ml测试管）或2万个细胞（2ml测试管）（均为稀释平板法测定）。在生物发光光度计上测出的初始发光量应在600-1900mV之间，低于600mV允许将倍率调至“×2”档，高于1900mV允许将倍率调整至“×0.5”档。仍达不到标准者，更换冻干粉。
9 L0 h4 I6 q# t, l: z0 n" T! c　　④氯化钠溶液，3g/100m1：取氯化钠3g于玻璃容器内，用量筒加蒸馏水l00ml。
　　⑤氯化钠溶液，2g/l00ml取氯化钠2g，加蒸馏水l00ml于试剂瓶内，2-5℃保存。
　　⑥参比物 HgCl2标准溶液：0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.18、0.20、0.22、0.24mg/L。
/ s3 m- Y# \# W# e9 d+ [　　⑦ HgCl2母液，ρ=2000mg/L:1/万分析天平精称密封保存良好的无结晶水 HgCl20.1000g于50ml容量瓶中，用3g/100m1氯化钠溶液稀释至刻度，置2-5℃冰箱备用，保存期6个月。
; M" Q1 o, H1 ?' K. C. G- h　　⑧ HgCl2工作液，ρ=2mg/L：用移液管吸 HgCl22000mg/L母液l0ml于l000ml容量瓶中，用3g/l00ml氯化钠溶液定容。再用移液管吸取 HgCl220mg/L液25ml于250m1容量瓶中，用3g/l00m]氯化钠溶液定容。将此液倒入配有半微量滴定管的试液瓶，然后用3g/l00ml氯化钠溶液，将 HgCl22mg/L溶液按表5-3-6稀释成系列浓度（一律采用50ml容量瓶）。 HgCl2工作液保存期不能超过24h，超过者务必重配。
3 c6 L" f6 b+ ]! b# g　　5.试验程序
　　(1)稀释样品液
6 _+ b; u2 S8 X' E3 u- M　　①样品液测定前稀释的条件：
　　样品液预试验：取事先加氯化钠至3g/l00ml浓度的样品母液2m1装入样品管，并设一支CK管（氯化钠3g/100m1溶液），按4②一③所述测定相对发光度。
+ T9 ^( Q: B( B* p" `9 U7 a$ \/ ]　　若测得的样品，相对发光度低于50％乃至零，欲以EC50表达结果，则需稀释。
　　若测得的样品，相对发光度在1％以上，欲以与相对发光度相当的 HgCl2浓度表达结果，则不需稀释。
　　②样品液的稀释液：样品液的稀释液一律用蒸馏水，在定容前一律按构成氯化钠3g/100ml的浓度添加氯化钠或浓溶液（母液只能加固体）。
　　③样品液稀释浓度的选择：
3 Y( J' x9 g" p8 F* Y　　预试验：按对数系列将样品液稀释成五个浓度：100%、10%、1%、0.1%、0.01%（其对数依次为0、-1、-2、-3、-4)，按5(2）和5(3）所述粗测一遍，视1％-100%相对发光度落在哪一浓度范围。
　　正式试验：在1%-100％相对发光度所落在的浓度范围内增配到6-9个浓度（例如，若落在0.1％-10％之间，则应稀释成0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%；若落在1％-10％之间，则应稀释成1%、2%、4%、6%、8%、10%)，按5(2）-(3)所述再测一遍；这6-9个浓度，也可通过查对数表，按等对数间距原则自行确定（例如，若落在1％-10％之间，则应稀释成10%、6.31%、3.98%、2.51%、1.58%、1.00%其对数相应为1.00、0.80、0.60、0.40、0.20、0.00，对数间距均为0.2)。
8 T. n! G- z! m# e( E　　(2)测定条件
　　①室温：20-25℃。
　　同一批样品在测定过程中要求温度波动不超过±1℃，且所有测试器皿及试剂、溶液测前1h均置于控温的测试室内。
2 m" {1 G( O% l8 i8 I, f　　②pH：若需测定包括pH影响在内的急性毒性，不应调节待测样品pH。
　　若需测定排除pH影响在内的急性毒性，需在测定前将待测样品和CK（氯化钠3g/100m1）的pH调至下值：主要含Cu的水样为4.5，主要含其他金属的水样为5.4，主要含有机化合物的水样为7.0。
　　③溶解氧：本法只能测定包括溶解氧影响在内的急性毒性。
　　(3)测定步骤
0 \+ p5 [5 Y- e5 h8 f/ A0 c　　①试管的排列：于塑料或铁制试管架上按以下两种情况排列测试管。
　　a．按5(1)①所述，样品母液相对发光度为1％以上者，如下排列：
" T! w1 k( x3 O( W8 D　　左侧放参比物 HgCl2系列浓度溶液管，右侧放样品管。前排放 HgCl2溶液和样品管，后一排放对照（CK）管，后二排放CK预试验管。每管 HgCl2或样品液均配一管CK（氯化钠3g/100m1蒸馏水溶液）。设三次重复。每测一批样品，均需同时配置测定系列浓度 HgCl2标准溶液。
　　b．按5(1)①所述，样品母液相对发光度为50％以下乃至零者，如下排列：
　　左侧仅放 HgCl20.10mg/L溶液管（作为检验发光细菌活性是否正常的参比物浓度，其反应15min后的相对发光度应在50％左右），右侧放样品稀释液管（从低浓度到高浓度依次排列）。其他同a。每测一批样品，均需同时配测 HgCl20.10mg/L溶液。
　　②加3g/l00ml氯化钠溶液：用5ml的定量加液瓶给每支CK管加2m1或5ml氯化钠3g/l00ml（据仪器型号而定）。
4 E8 `3 S+ ]" t! h6 L1 s　　③加样品液：用2ml或5ml吸管给每支样品管加2ml或5ml样品液（据5(3)②而定）。每个样品号换一支吸管。
　　④发光细菌冻干菌剂复苏
　　从冰箱冷藏室2-5℃取出含有0.5g发光细菌冻干粉的安瓿瓶和氯化钠溶液，投入置有冰块1-1.5L保温瓶，用lml注射器吸取0.5m1冷的氯化钠2g/l00m1（适用于5ml测试管）或lml冷的2.5%氯化钠（适用于2m1测试管）注入已开口的冻干粉安瓿瓶，务必充分混匀。2min后菌即复苏发光（可在暗室内检验，肉眼应见微光）。备用。
　　⑤仪器的预热和调零：打开生物发光光度计电源，预热15min，调零，备用。
　　⑧检验复苏发光细菌冻千粉质量：另取一空2m1或5ml测试管加2m1或5ml氯化钠3g/100ml（据5(3)②而定），加10μ1复发光菌液，盖上瓶塞，用手颠倒五次以达均匀。拔去瓶塞，将该管放入各自型号仪器测试舱内，若发光量立即显示（或经过5-l0min上升到）600mV以上，此瓶冻干粉可用于测试，低于者按4③处理。菌液发光量先缓慢上升，约持续5-15min，后缓慢下降，约持续4h。满4h的CK发光量应不低于400mV，低于者更换冻干粉。
　　⑦给各测试管加复苏菌液：在发光菌液复苏稳定（约0.5h)后，按5(3)所述，从左到右，按 HgCl2或样品管（前）-CK管（后）一 HgCl2或样品管（前）-CK管（后）…顺序，用10μl微量注射器（勿用定量加液器以减少误差）准确吸取10μl复苏菌液，逐一加入各管，盖上瓶塞，用手颠倒五次，拔去瓶塞，放回原位（每管加菌液间隔时间勿短于30s。每管在加菌液的当时务必计时，记录到秒，即为样品与发光菌反应起始时间。立即将此时间加15min，记作各管反应终止（即应该读发光量）的时间。
4 A+ S: R( ]+ o( N! \　　⑧发光细菌与样品反应达到终止时间的读数：按各管原来加菌液的先后顺序，当某管达到记录的反应终止时间，在不加瓶塞的情况下，立即将测试管放入仪器测试舱，读出其发光量（以光信号转化的电信号一电压毫伏数表示）。
* b( v, ^9 b( C' j$ }7 v7 N　　⑨有色样品测定干扰的校正：
　　a．拿掉仪器样品舱上的黑色塑料管口；
　　b．取－2m1测试管（直径12mm)，加氯化钠3g/ml溶液2m1，将该管放进一装有少量氯化钠3g/100m1溶液的5ml管（直径20mm）内，要使外管与内管的氯化钠3g/l00ml液面平齐。此作CK管；
+ x8 T6 d% S+ B2 d4 E8 O0 j2 f　　c．另取一2ml测试管，加氯化钠3g/ml溶液2ml，放入另一装有少量有色待测样品液的5ml管内，要使外管与内管的氯化钠3g/ml液面平齐。此作CKc管；
! B; _$ Q( @: v5 d　　d．于CK和CKc二管的内管中同时加复苏发光菌液10μ1（注意：必须是本批样品测
　　定所用同一瓶复苏菌液），立即记时到秒，等反应满15min，迅速放入仪器测试舱，测定两支带有内管的5ml测试管的发光量。分别记下发光量Ll(CK管）和L2(CKc管）；
- M# ?$ R' F# M5 @! S' P3 T3 X% z) N　　e．计算因颜色引起的发光量（mV）校正值ΔL=L1一L2；
　　f.按5(3)⑦和5(3)⑧所述常规步骤测试带色样品管及其CK管（氯化钠3g/l00ml溶液）的发光量（mV)。所有CK管测得之发光量（mV）均须减去校正值ΔL(mV）后才能作为CK发光量（mV)。
( N% Y( b, i7 x; Y  |. y　　有色样品溶液测定干扰的校。
　　6．质量保证与质量控制
　　①每支发光菌的发光强度和稳定性不尽相同，同批样品测定过程中应使用同一支发光菌，如果需做 HgCl2标准曲线，也应与样品使用同一支发光菌。如果一支不够用，可采用同批的两支混合后使用。
5 N  x6 k0 H7 J0 {　　②上一般通用反应时间为5min或15min两种，鉴于我国目前所用发光杆菌的灵敏度和稳定性，采用15min。
8 ^2 q: C. ]. \' L  K; d" |　　③三次重复测定结果相对偏差确定为≤1％。
　　④测定应在采集样品后立即进行，在6h内不能测定应低温保存，但不得超过24h。
6 m" [. M) ~( ?  e; ~" O0 N2 f　　⑤关于样品如何稀释的问题，一般根据样品毒性大小决定，但是在试验中至少要选择六个不同浓度。如果六个浓度的相对发光度在1%-100％之外，可增配若干个浓度，使之落在1%-100％相对发光度范围内，以求相关方程。
# H- s, h& O  R& r' G4 c　　⑥如果样品浓度为MAX高极限浓度（即100%）时，其相对发光率都不能使发光强度减少50%，则对样品的EC50值只能示为＞100%。
　　⑦鉴于发光细菌法实验因素的影响，实验结果具有一定误差。在评价毒物的剂量一效应关系时，应确定95％置信区间，即T=a+bC±2SE（SE为剩余标准差），以此求出的EC50也有一定的区间，可根据这些结果确定实验结果的准确性和真实性。对于实验结果的重现性，就大多数而言，一般EC50值的变异系数在6％-10%。
　　7.测试结果的表达
　　1)计算样品相对发光度（％），并算出平均值：
　　相对发光度（%)= HgCl2管或样品管发光量（mV)/CK管发光量（mV)×100
　　相对发光度（％）平均值＝（重复1）（%）+（重复2）（%）+（重复3）（%）/3
8 M; ?8 V* L' J0 q6 b& H6 y( `* k　　2）符合5(1)①中样品母液相对发光度在1％以上者，建立并检验 HgCl2浓度（C)与其相对发光度（T，％）均值的相关方程，也可以绘制关系曲线。
: K1 k- b; P; @) {! S9 f1 g0 s　　①求出一元一次线性回归方程的a（截距）、b（斜率、回归系数）和r（相关系数），列出方程：
, o1 Y+ d- v% t9 V　　T=a+bC HgCl2
　　查相关系数显著水平（P值）表，检验所求r值的显著水平。若P≤0.01，且EC50 HgCl2=0.lomg/L±0.02mg/L，则所求相关方程成立；反之，不能成立，必须重测系列 HgCl2浓度的发光量。 HgCl2溶液配制过夜者，必须重配后再测定。
　　②也可以据建立的上述方程绘制关系曲线。即发光度为10％和90%，代入上式，求出相应的二个 HgCl2浓度，在常数坐标纸上，定出二点，画一直线，即为符合该方程的 HgCl2浓度与相对发光度的关系曲线。
　　3)符合5(1)①中样品母液相对发光度低于50％乃至零，欲以EC50表示结果者，建立并检验样品稀释浓度（C）与其相对发光度（T)均值的相关方程，绘制关系曲线。
: T6 a% G+ E' R0 J6 b% r/ {! N　　按7之2)所述方法建立相关方程T=a+bC样，并检验相关系数r、显著水平（P值）。
　　若P≤0.05，则所求相关方程成立；反之，不能成立，必须重测样品稀释系列浓度的发光量。
& q& L- n( S2 g* c8 V' E- B# X- N　　8．结果评价和报告
  o& ^$ H" g4 p- `! u/ e　　(1)用 HgCl2浓度表达样品毒性
2 @2 b* `( i1 N2 I3 }* l　　1)适用的条件：符合条件（样品母液相对发光度＞1%）并按7之2)建立了合格（(P≤0.01、EC50 HgCl2=0.10mg/L±0.02mg/L）的 HgCl2浓度与其相对发光度相关方程者。
　　2）表达方法：
　　①将测得的样品相对发光度，代入7之2)的相关方程，求出与样品急性毒性相当的 HgCl2浓度（一般用mg/L）表示。
　　②测试结果报告同时列举样品相对发光度及其相当的 HgCl2浓度值。
　　3)适用性：适用于相对发光度在1％以上，特别是50％以上（即不可能出现EC50值）但低于100%（即仍有中、低水平毒性）的样品毒性测定。
　　(2)用EC50值表达样品毒性
1 ]* O/ X' \' C% Y0 j　　1)适用的条件：符合条件（样品母液相对发光度低于50％乃至零）并按7之3)建立了合格（P≤0.01）的样品稀释液浓度与其相对发光度相关方程者。
　　2）表达方法：
$ u7 a7 L6 [% [　　①将T代入7之3)建立的相关方程，求出样品的EC50值。这里的EC50值以样品的稀释浓度（一般用百分浓度）表示。
! r3 z8 u, G5 M  Z6 y& W　　②测试结果报告列举样品的EC50值。
. ]8 }3 p& h) d6 `; Y5 L$ Q: F　　3）适用性：适用于相对发光度在50％以下，特别是零（即毒性水平较高或很高）的样品毒性测定，后者无法以相当的 HgCl2浓度表达毒性。
　　(3）测定记录格式
　　(4）测定结果报告
' \3 S4 t$ O: e; b2 s　　①实验室室温。
. O( M- j" n& z" N9 A- K+ H! O　　②采样地点、日期、时间。
9 J0 @3 e' Z1 a  I3 T　　③ HgCl2浓度或样品稀释百分浓度与相对发光度的相关方程：
　　T=a+bC
　　r= P≤ EC50 HgCl2= mg/L
　　L=a+bC a= b=
- w' X# Q7 w! L% J9 b# Q　　回归方程 r= P＜
7 S* N3 Y+ a8 M3 J" H4 i4 J　　④样品EC50值（稀释百分浓度）或相对发光度（％）及相当的 HgCl2浓度（mg/L）。
4 f/ X2 |, Z; a- f3 K$ K转载自：化工仪器网